香港牡蠣 Crossostrea sikamea 廣泛分布于中國 廣東、廣西海域，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富全面，素 有 “海洋牛奶”之美名。牡蠣是第一批入選食 藥同源的食物，其具有抗氧、免疫、抗疲勞、抗腫瘤、抑菌、改善記憶、解酒護(hù) 肝等功能活性，這為進(jìn)行創(chuàng)傷愈合研究奠定了 理論基礎(chǔ)，但尚未有對(duì)其進(jìn)行深入的營養(yǎng)保健或藥 用價(jià)值相關(guān)報(bào)道，因此，有必要對(duì)牡蠣的功能價(jià)值 進(jìn)行充分開發(fā)利用。

1 材料與方法

1. 1 材料

試驗(yàn)用牡蠣肉購自廣西欽州。試驗(yàn)用 SPF 級(jí) 昆明小鼠體質(zhì)量為 ( 20±2) g，雄性，購自山東省 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)單位使用許 可證編號(hào) SYXK ( 粵) 2014－0053。云南白藥購自 云南白藥集團(tuán)。抗菌試驗(yàn)所需菌株由廣東省水產(chǎn)品 加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 試驗(yàn)試劑: 動(dòng)物蛋白酶 ( 3 萬 U/g) 購自廣西 南寧龐博生物工程有限公司; 白介素－6 ( interleukin 6，IL － 6) 、白 介 素 － 10 ( interleukin 10，IL － 10) 、生長因子轉(zhuǎn)化生長因子 β ( transforming growth factor－β，TGF－β) 、堿性成纖維細(xì)胞生長因 子 ( fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF－2) 、表皮細(xì)胞 生長因子 ( epidermal growth factor，EGF) 、細(xì)胞生 長周期素 1 ( Cyclin D1，CCND1) 和羥脯氨酸測定 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 試驗(yàn)儀器: Lynx 6000 型高速冷凍離心機(jī)、多 功能酶標(biāo)儀購自 Thermo 公司; BSA224S－CW 型萬 分之一電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器 ( 北京) 有限公司; FE28 型 pH 計(jì)購自梅特勒—托利多儀 器 ( 上海) 有限公司; DF－101T 集熱氏恒溫加熱 磁力攪拌器購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司; FDU－1110 型冷凍干燥機(jī)購自上海愛朗儀器有限公 司; SW－CJ－2FD 型雙人超級(jí)操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè) 備有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 EPO 制備工藝

將牡蠣肉清洗、打漿，pH 值調(diào)至 7. 0，加入 1000 U/g ( 蛋白) 的動(dòng)物蛋白 酶，酶解 5 h，滅酶 10 min，以 8000 r/min 離心， 濃縮，冷凍干燥。采用凱氏定氮法、甲醛滴 定法和雙縮脲法分別測定蛋白質(zhì)含量、水解度 和肽含量。

1. 2. 2 EPO 體外抗菌試驗(yàn)

采用微量徑向擴(kuò)散法 和半數(shù)稀釋法測定 EPO 對(duì) 6 中革蘭氏陽性菌和 7 種革蘭氏陰性菌的抗菌活性。

1. 2. 3 EPO 體表促凝血試驗(yàn)

用斷尾法測定 EPO 對(duì)小鼠體表創(chuàng)口出血時(shí)間和出血量的影響。

1. 2. 4 EPO 急性皮膚毒性試驗(yàn)

選取 SPF 級(jí)昆明 小鼠 10 只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組和 EPO 涂抹組。 試驗(yàn)方法參考。

1. 2. 5 動(dòng)物分組及創(chuàng)傷模型建立

選取 SPF 清潔 級(jí)昆明雄性小鼠 60 只，隨機(jī)分為 3 組，每組 20 只，分別為陰性對(duì)照組、云南白藥陽性對(duì)照組和 EPO 給藥組。將小鼠用 10%水合氯醛腹腔麻醉后， 背部剃毛、消毒。在小鼠背部剪去直徑約 0. 8 cm 的全層皮膚，造成全皮層創(chuàng)傷動(dòng)物模型。每只小鼠 均分籠飼養(yǎng)，給藥組每天涂抹 30 ～ 35 mg EPO ( 肽 含量為 1. 5 ～ 2. 5 mg) ，陽性對(duì)照組每天涂抹 2 ～ 3 mg 云南白藥，陰性對(duì)照組不做任何處理。每 2 天 對(duì)小鼠創(chuàng)傷口面觀察、拍照、測量傷口大小，并記 錄結(jié)果。

1. 2. 6 愈合率及瘢痕縮小率

每隔 2 d 用游標(biāo)卡 尺測量創(chuàng)面直徑大小一次，計(jì)算創(chuàng)傷愈合率: 創(chuàng)傷愈合率= ( 第 0 天創(chuàng)面直徑－第 n 天創(chuàng)面 直徑) /第 0 天創(chuàng)面直徑×100%， 瘢痕縮小率= ( 第 0 天創(chuàng)面直徑－第 14 天瘢痕 長度) /第 0 天創(chuàng)面直徑×100%。

1. 2. 7 瘢痕組織中生化指標(biāo)測定

小鼠創(chuàng)面組織 勻漿液制備，分裝于－80 ℃ 下保藏 待測。IL－6、IL－10、TGF－β、FGF－2、EGF、CCND1 和羥脯氨酸含量的檢測均按照試劑盒說明書 進(jìn)行。

1. 3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn) 差 表 示 ( mean ± S. D. ) ，每組試驗(yàn)至少重復(fù) 3 次，采用 SPSS 20 軟 件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用 LSD 檢驗(yàn)，顯 著性水平設(shè)為 0. 05。

2 結(jié)果與分析

2. 1 牡蠣酶解產(chǎn)物 ( EPO) 的基本性質(zhì)

本試驗(yàn)中自制的 EPO 主要質(zhì)量指標(biāo)為加酶量 為 1000 U/g， 蛋白的牡蠣酶解液水解度為 26. 33%，EPO 的蛋白質(zhì)含量為 43. 54 g /100 g，肽 含量為 25. 26%。

2. 2 體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果

采用微量徑向擴(kuò)散法和半數(shù)稀釋法測定 EPO 對(duì)常見的 13 種菌株的抑制作用，其中 6 種革蘭氏 陽性菌株分別為金黃色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus、芽孢桿菌 Bacillus、李斯特菌 Listeria monocytogenes、海豚鏈球菌 Streptococcus iniae、格氏乳球 菌 Lactococcus garviea 和 無 乳 鏈 球 菌 Streptococcus agalactiae，7 種革蘭氏陰性菌分別為大腸 桿 菌 Escherichia coli、銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa、溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus、副溶血性弧菌 V. Parahemolyticus、海藻希瓦氏菌 Shewanella algae、 哈氏弧菌 V. harveyi 和嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila。體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，EPO 無抗菌活 性。

2. 3 體表促凝血試驗(yàn)結(jié)果

EPO 對(duì)小鼠體表創(chuàng)口出血時(shí)間和出血量的影 響如表 1 所示，與陰性對(duì)照組相比，EPO 可縮短 出血時(shí)間和減少出血 量，但無顯著性差異 ( P ＞ 0. 05) ，而云南白藥陽性對(duì)照組則極顯著好于其他 組 ( P＜0. 01) 。這表明，EPO 不具有促凝血作用。

2. 4 EPO 急性皮膚毒性試驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)涂抹 EPO 3 d 后，所有小鼠均未出現(xiàn)紅斑 和水腫現(xiàn)象。停藥后繼續(xù)觀察 2 d，也未出現(xiàn)紅斑 和水腫，且均未出現(xiàn)動(dòng)物體質(zhì)量下降、站立不穩(wěn)、 精神萎靡等其他異常變化。這表明，EPO 對(duì)小鼠 無毒性。

2. 5 EPO 對(duì)小鼠皮膚傷口愈合作用的影響

各組愈合情況如圖 1 所示，造模后第 2 天，各試驗(yàn)組動(dòng)物皆已結(jié)痂，傷 口周圍出現(xiàn)紅腫，無液體滲出，傷口收縮均不明 顯。第 2、4 天時(shí)，各組創(chuàng)面結(jié)痂局部不斷變硬， 創(chuàng)傷周圍表面不平整，創(chuàng)緣皮膚收縮較明顯。第 6、8、10 天時(shí)，陰性對(duì)照組傷口結(jié)痂不斷變厚， 呈黑紅色，但瘢痕面積變化小; 陽性對(duì)照組傷口縮 小，并開始部分脫痂、縮痂明顯; EPO 給藥組在 第 6 天時(shí)已掉痂，縮痂明顯優(yōu)于兩對(duì)照組。第 12 天時(shí)，各組皆已掉痂，愈合處開始長出毛發(fā)，其中 給藥組進(jìn)一步縮痂。第 14 天時(shí)，陰性對(duì)照組的多 數(shù)傷口直徑小于 2 mm，各給藥組傷口直徑均小于 1 mm，呈現(xiàn)肉紅色新生皮膚，新生肉色組織完整。 給藥組較陰性對(duì)照組愈合情況良好，無增生性瘢痕 及瘢痕疙瘩生成。

3 結(jié)論

本研究中針對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合全階段試驗(yàn)指標(biāo)的選擇，進(jìn)行體外試驗(yàn)及涂抹給藥的動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果 表明，在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中，涂抹牡蠣酶解產(chǎn)物 通過抑制炎癥作用，促進(jìn)生長因子分泌及膠原蛋白 的沉積與交聯(lián)，從而加快了小鼠軟組織開放性創(chuàng)傷 愈合，且對(duì)淺表瘢痕增生具有一定的抑制作用。本 研究發(fā)現(xiàn)并開拓了皮膚創(chuàng)傷愈合活性物質(zhì)的來源， 但其具體作用功能因子尚不確定且機(jī)理不明，后續(xù) 試驗(yàn)將對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，以進(jìn)一步闡 釋其機(jī)理。



 

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