目前，將質(zhì)粒 ＤＮＡ 導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法有很 多，最常用的方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)法、顯微 注射法和磷酸鈣共沉淀法等。雖然脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方 法已經(jīng)普遍使用，且具有性質(zhì)穩(wěn)定和轉(zhuǎn)染效率高等 優(yōu)點(diǎn)，但是價(jià)格較為昂貴；而磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法使 用成本較低，對(duì)具體體系加以?xún)?yōu)化后，能夠達(dá)到較 好的轉(zhuǎn)染效率，特別是對(duì)于２９３Ｔ 細(xì)胞來(lái)說(shuō)，與脂 質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率無(wú)明顯差異。隨著慢病毒感染技 術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，各種分子生物學(xué)技術(shù)及基因技術(shù) 的改進(jìn)，生命科學(xué)研究領(lǐng)域越來(lái)越多地應(yīng)用到慢病 毒包裝技術(shù)，因此，建立起經(jīng)濟(jì)高效的２９３Ｔ 細(xì)胞 的轉(zhuǎn) 染 方 法 至 關(guān) 重 要。１９７３ 年，ＧＲＡＨＡＭ 等首次報(bào)道磷酸鈣轉(zhuǎn)染法。

１ 材料與方法

１．１ 載體、細(xì)胞、主要試劑和儀器

反轉(zhuǎn)錄病毒 表達(dá) 載 體 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 由 本 實(shí) 驗(yàn) 室 構(gòu)建保存；人胚腎細(xì)胞２９３Ｔ 由福建醫(yī)科大學(xué)消化 道 腫 瘤 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室 提 供；ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、 Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ 培養(yǎng)基和胎牛血清 （美國(guó) Ｇｉｂｃｏ公司）， ＮａＣｌ ［上海國(guó)藥 （集團(tuán)）化學(xué)試劑有限公司］，葡 萄糖和 ＫＣｌ２ ［中國(guó) 醫(yī) 藥 （集 團(tuán)）上 海 化 學(xué) 試 劑 公 司］，ＣａＣｌ２ ·２Ｈ２Ｏ 和 Ｎａ２ＨＰＯ４ ·１２Ｈ２Ｏ ［生 物 工程 （上 海 ） 股 份 有 限 公 司 ］，ＨＥＰＥＳ （臺(tái) 灣 ＶＷＲ 公 司）， 單 抗 兔 抗 ｆｌａｇ 單 克 隆 抗 體 （１∶ １０００，中 國(guó) ＢＯＳＩＳ 公 司 ）， 單 抗 小 鼠 抗 β－ａｃｔｉｎ （１∶２０００，美國(guó) ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ 公 司）。凝 膠 成 像 系統(tǒng)購(gòu)于英國(guó)Ｓｙｎｇｅｎｅ公司，無(wú)菌潔凈工作臺(tái)購(gòu)于 蘇州凈 化 設(shè) 備 有 限 公 司，ＳＨＰ－１５０型生化培養(yǎng)箱購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｃａｍ５１２ 倒 置 熒 光 顯 微 鏡 購(gòu) 于 德 國(guó) Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ公司。

１．２ 細(xì) 胞 培 養(yǎng)

用 ＤＭＥＭ 培 養(yǎng) 基， 并 添 加 １０％胎 牛血 清，在 ３７℃、５％ＣＯ２ 培養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng) ２９３Ｔ 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 前 １ｄ２９３Ｔ 細(xì) 胞 傳 代，重 新 種 板，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合度為４０％～６０％。

１．３ 質(zhì)粒來(lái)源和轉(zhuǎn)染效率的計(jì)算

本課題組構(gòu)建 了 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 質(zhì) 粒，由 于 質(zhì) 粒 能 夠編碼 ＧＦＰ蛋白，該蛋白在熒光顯微鏡下能夠被 激發(fā)出綠色熒光，可以作為比較轉(zhuǎn)染效率的計(jì)數(shù)標(biāo) 志。熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染２４和４８ｈ后 ２９３Ｔ 細(xì) 胞編碼綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算其占相同視 野下總 的 ２９３Ｔ 細(xì) 胞 數(shù) 目 的 百 分 率，即 為 轉(zhuǎn) 染 效 率。

１．４ 傳統(tǒng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染

２９３Ｔ 細(xì)胞 轉(zhuǎn) 染 前 １ｈ換新 鮮 無(wú) 血 清 培 養(yǎng) 基，在５ｍＬ 的圓 底 試 管 底 部加入２５μＬ摩爾濃度為 ２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＣａＣｌ２水 溶液 和 ２μｇｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 質(zhì)粒，加入無(wú)菌水 至２２０μＬ，小心 混 勻，且在劇烈吹打下 加入２２０μＬ ＨＥＰＥＳ緩沖 液；圓底試管垂直放在 混旋 器 上 混 旋１０ｓ，室溫 靜 置３０ｍｉｎ；逐滴 加 入 ２９３Ｔ 細(xì)胞，輕輕 晃 動(dòng) 混 勻；８～１２ｈ 換含 血 清 培 養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染２４和４８ｈ后熒光顯微鏡下觀(guān)察綠色熒 光。相同方法處理ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ｖｅｃｔｏｒ質(zhì)粒。

１．５ 改良磷酸

鈣 轉(zhuǎn) 染 法 轉(zhuǎn) 染２９３Ｔ 細(xì)胞 轉(zhuǎn) 染 前 １ｈ２９３Ｔ 細(xì)胞更 換３７℃預(yù)熱 的 無(wú) 血 清 培 養(yǎng) 基，在 １．５ｍＬＥＰ管中加入２２０μＬ無(wú)菌水；在水中央加 入 ２μｇｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 質(zhì) 粒；２５μＬ 摩爾濃度為２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 ＣａＣｌ２水溶液小心地 加到 ＥＰ管的 底 部，沿 管 壁 小 心 逐 滴 加 入２５０μＬ ＨＥＰＥＳ緩沖液至液面；在 ＣａＣｌ２ 與上 層 溶 液 之 間 形成的分層處，用２００μＬ 移液槍輕柔吹打，擾亂 分界；室溫放置３０ｍｉｎ；逐滴加入２９３Ｔ 細(xì)胞，輕 輕晃動(dòng)混勻；８～１２ｈ換含血清培養(yǎng)基，２４和４８ｈ 后熒 光 顯 微 鏡 下 觀(guān) 察 綠 色 熒 光。相 同 方 法 處 理 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ｖｅｃｔｏｒ質(zhì)粒。

２ 結(jié) 果

轉(zhuǎn)染２４和４８ｈ后，與傳統(tǒng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 （４９．３％± ７．０２％和６４．７％ ±１１．９％）比較，改 良 磷 酸 鈣 轉(zhuǎn) 染 法 轉(zhuǎn) 染 效 率 （６９．３％ ±８．０２％ 和 ９４．３％ ± ５．０３％）明 顯 升 高 （Ｐ ＜０．０５）。轉(zhuǎn)染２４和４８ｈ后，改良磷酸鈣轉(zhuǎn)染 法轉(zhuǎn)染２９３Ｔ 細(xì)胞中 ＴＲＡＦ６ｍＲＮＡ 表達(dá)水平明顯 高于傳統(tǒng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 （Ｐ＜０．０１）。轉(zhuǎn)染２４和 ４８ｈ 后，改良磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染 ２９３Ｔ 細(xì)胞中ｆｌａｇ蛋白表達(dá)水平明顯高于傳統(tǒng)磷酸 鈣轉(zhuǎn)染法 （Ｐ＜０．０１）。

３ 討 論

影響磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率的因素很多，如試 劑配置的濃度和ｐＨ 值等，因此本研究嚴(yán)格掌 握實(shí)驗(yàn)試劑的配置方法，特別是ｐＨ 值的大小和試 劑 的 劑 量 要 求 。轉(zhuǎn)染操作步驟嚴(yán)格按照參考文獻(xiàn)和本研究步 驟。操 作 的 不 同 點(diǎn)：

①傳 統(tǒng) 法 要求混旋操作步驟，而本研究的操作步驟無(wú)混旋；
②本研究操作只要求普通的 ＥＰ管，傳統(tǒng)法要求用 圓 底 試 管；
③ ２ 種 方 法 在 質(zhì) 粒 ＤＮＡ、 Ｈ２Ｏ、 ＨＥＰＥＳ和 ＣａＣｌ２ 的 加 樣 方 法 中 存 在 差 別。轉(zhuǎn) 染 ２４和４８ｈ 后熒光顯微鏡觀(guān)察顯示：傳統(tǒng)磷酸鈣轉(zhuǎn) 染法轉(zhuǎn)染效率明顯低于改良磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率，表明改良的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法效率更高。